Entretanto, transcurrían los últimos años del reinado de don Manuel en Portugal, sin que este país realizará tentativa alguna para ocupar la tierra de Santa Cruz. Las incursiones crecientes de piratas y traficantes de palo Brasil imponían la alternativa: ocupación o abandono de la tierra. Pero en 1521 le sucedió en el trono don Juan III, quien mostró desde un principio mayor interés por la colonia indefensa y abandonada, constituyendo una flota de seis naos, para su defensa, bajo el mando de Cristóbal Jacques, español al servicio de Portugal. Jacques se dirigió a la factoría de Pernambuco, fundada por él mismo en un viaje anterior, prosiguió luego hacia el sur, y en la bahía de Todos los Santos batió a los franceses, tomando 300 prisioneros (1529). La noticia, difundida entonces en Lisboa, de que el río de Solís abundaba en metales preciosos y se hallaba quizás dentro de la línea de demarcación convenida con España, dio motivo a una nueva expedición encomendada a Martín Alfonso de Souza, a quien se confió, con poderes extraordinarios, cinco naos y cuatrocientos soldados. Partió de Lisboa en compañía de su hermano Pedro López de Souza, el historiador de la expedición, en diciembre de 1530. Recorrió la tierra de Santa Cruz desde el cabo San Agustín hacia el sur. Llegó a Río de Janeiro en abril de 1531 y a la isla del Abrigo, junto al puerto de Cananea, en setiembre del mismo año.
Los aventureros españoles y portugueses que vivían en la comarca refirieron a Souza, como habían referido a Caboto, la leyenda de las riquezas que podían hallarse tierra adentro, eco también, probablemente, de los tesoros del Rey Blanco. Souza dispuso entonces el reconocimiento de las regiones del interior, y envió un destacamento de 80 soldados, arcabuceros y ballesteros, que perecieron poco después a manos de los salvajes. Después de haber perdido en la costa, junto al río Chuy, la nao capitana, Souza envió a su hermano Pedro López de Souza para que reconociese, como lo hizo, el río de Solís, en el que se internó por espacio de ciento quince leguas, comprobando que se hallaba fuera de la línea de demarcación. Mientras este viaje se realizaba, Martín Alfonso fundó, en un sitio ameno, a la vera del mar, la población de San Vicente, a fines de 1531. La nueva ciudad, destinada a influir decisivamente sobre la colonización de las comarcas del río de la Plata, comenzó a prosperar con gran rapidez, convirtiéndo a poco en centro de activa contratación comercial, frecuentado por navegantes y mercaderes de las más distintas nacionalidades. La fundación de San Vicente, como más tarde la del real y puerto de Buenos Aires, respondió a la misma necesidad náutica y militar de un buen fondeadero y abrigo para las naos frágiles en que navegaban: junto a la orilla, como el de San Vicente, pocas millas al sur de Santos en 1531, y el de Buen Aire en el año 1536, que garantiza la retirada en caso de contraste.
6. La noticia de estos viajes y el temor de que los portugueses usurparon tierras que se suponían al occidente de la línea de demarcación, alarmaron a la Corona de España. El embajador español en Lisboa denunció entonces las pretensiones de aquéllos a la ocupación de las tierras ribereñas del río de Solís, mientras el Consejo de Indias iniciaba diligencias y negociaciones encaminadas a evitar la temida usurpación. Con fecha 10 de mayo de 1535, la Corona concedió a don Pedro de Mendoza la conquista y población de las “tierras y provincias del Río de la Plata». Mendoza partió de Sanlúcar el 24 de agosto de 1535, con once años, a las que se agregaron otras tres en Canarias. Sumaban en su conjunto 1400 toneladas de porte, poco más o menos, las cuales transportaban en total, acaso, unos 1700 hombres de guerra, tripulaciones y pasajeros que viajaban a su costa.
Por ineptitud e imprevisión del adelantado y gobernador (tales fueron los títulos de Mendoza), y de sus criados y parientes, la expedición fue una serie de incidencias, errores y crímenes vulgares o atroces, encubiertos a veces por el sarcasmo de formas legales en apariencia, como el asesinato del maestre de campo Juan Osorio, consumado en la bahía de Río de Janeiro, el 30 de noviembre, después de condenado sin defensa a ser muerto a puñaladas o estocadas «hasta que el alma le saliese de las carnes”, tras de lo cual se continuó el proceso; simple crónica de maleantes y forajidos, en la que falta por completo el acento dramático, el destello trágico de los Pizarro y Almagro, que explica y atenúa otros crímenes semejantes, idealizados más tarde por la creación artística de grandes prosistas. Las cuatro naves en que viajaban el adelantado y parte de la expedición llegaron al río de la Plata en los primeros días del año 1536. En la isla de San Gabriel se hallaban fondeadas las restantes, que habían ido a cargo del almirante de la armada, don Diego de Mendoza, y de las cuales se habían separado durante la travesía del Atlántico. Pocos días después, a fines de enero, cruzaron el río. Iban los pilotos sondeando constantemente, según lo pedía la precaución acostumbrada de la navegación por aguas interiores ignoradas o apenas conocidas; y así traspusieron la boca del Riachuelo. A media legua de su desembocadura, poco más o menos, hallaron aquéllos una ensenada sobre la margen izquierda, donde la corriente formaba como un remanso que ofrecía perfecto abrigo para las naos.
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